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色谱图上最重要的坐标

时间:2019-06-17 08:22   作者:天谱分析仪器 点击: 次
众所周知,色谱的分离是以保留(Retention)为前提的(SEC除外),不同组分在固定相上有差别的保留最终造就分离(Separation)。保留的本质是固定相(StationaryPhase)对流动相(MobilePhase)中目标物的挽留,保留的大小则取决于流动相和固定相对目标物的争夺。保留的一个极端是无保留(固定相对目标物基本没有吸引力),另一个极端则是永久保留(固定相对目标物吸引太强,年初上班打了一针,年末放假还没出峰)。前者无法形成分离,后者没有效率。什么样的保留既能满足分离又能照顾效率呢?死时间是一把最好的尺子。
死时间是指不被保留的化合物进入色谱系统到其封峰顶被检出的时间,这是可以被直接测出来的指标。在色谱曲线上,保留强弱最直观的信息就是保留时间(Retentiontime)的大小,然而仅靠保留时间无法给出更多的信息。此时,把死时间引进来,创造出了容量因子(CapacityFactor)的概念。
k=(tR-t0)/t0                      公式1
k为容量因子;tR为保留时间,min;t0为死时间,min;当目标物在死时间位置出峰,那么tR= t0,容量因子为0,此时保留最小,目标物和溶剂及某些不保留杂质(视基质复杂程度而定)的色谱峰确定会重合。图1为5种目标物标准样品的分析,图上标t0的位置(1.660min)为死时间(如何确认死时间下文详谈),通过公式1计算,5种化合物的容量因子分别为0.079、0.376、2.578、3.081、3.881。大量实践证明,对于等度分析,容量因子应处于0.5~20之间,小于0.5时,目标物与保留较弱的杂质分离差;大于20,分析时间过长,而且出峰晚的目标物展宽严重,灵敏度下降。图1中第一个目标物已经陷在溶剂峰附近,积分困难。假如是含有基质的样品,干扰会更严重。
某些分析工作者可能会说,有时遇到难分离的一对目标物,期待通过降低流动相洗脱强度、增大容量因子的做法改善分离。笔者认为,这种想法很危险,因为k/(k+1)正比于分离度R,当k超过10时,k的增加对于k/(k+1)的增大几乎无效。所以笔者的建议k处于1~10之间甚至更适宜。当然,基质的复杂程度不一,k大于1是优化分离的必要条件而非充分条件。
 
图1. 死时间与保留时间
探索等度洗脱条件时,死时间和容量因子也可以发挥极其重要的作用。寻找合适的等度洗脱条件通常有两个办法:其一,先用高洗脱强度流动相洗脱,让色谱峰较快流出,然后逐渐降低洗脱强度,让目标物的容量因子处于合适范围;其二,在流动相比例全范围内设置梯度洗脱,然后从梯度曲线上查出。关于第一种方法,也可以公式去预测,比逐渐降低洗脱强度省时间。
对于小分子化合物,容量因子k与有机相%B存在如下关系:
lgk=lg kw - S(%B/100)     公式2
目标物分子量小于500 Da时,S约等于4,这表明B浓度每下降10%,化合物的k值约增大2.5倍。在反相色谱中,B的浓度对应于纯甲醇或纯乙腈。还是以图1为例,洗脱条件为75%甲醇水溶液,假如把甲醇比例降为65%,化合物1-5的容量因子将分别增大到0.198、0.940、6.445、7.603、9.703,而保留时间预计变为1.988、3.220、12.359、14.281、17.767 min。上述属于预测模型,与真实值肯定有差别,但大体范围一致。
死时间附近是弱保留杂质集中出峰的地方,比如样品溶剂本身、样品中的无机盐(注意:无机盐在反相色谱中是无保留的,在HILIC中未必如此)以及某些大分子化合物。使用蒸发光检测器、电喷雾检测器或质谱检测器时,可以在死时间与第一个目标物保留时间选择一个点,让该点前的流动相不要流入检测器,以便保护检测器免遭污染。
会不会有化合物在死时间前面出峰?答案是确定的,而且至少有两种情形:其一,前一针或前几针进样中,有组分/杂质在分析时间未能被洗脱,而在后续的采集时间内出峰,恰巧出在了死时间前,这种峰的特点是区域宽度非常宽。其二,大分子化合物。第二种情形的出现需要了解色谱柱内部的世界。
全多孔硅胶颗粒键合相在液相色谱柱中应用最为广泛,下面我们介绍一下这种色谱柱内部的构造。
 
 
图2. 液相色谱柱剖面图
 
 
图3. 球形硅胶颗粒的堆积图(等径最密堆积方式)
 
 
 
图3. 内部布满微孔的全多孔硅胶颗粒
图2是液相色谱柱柱管的剖面图,柱管中填满了硅胶颗粒,柱床体积等于πr2L(r为色谱柱内径的一半,L为柱长)。硅胶颗粒的堆积形态如图3,硅胶微球间存在规则的间隙,因为微球的直径不小于1.7μm,所以微球的间隙至少能让零点几微米的颗粒物通过。图4则显示了任一个全多孔硅胶颗粒的结构,可以发现微球内部存在众多的微孔,这些微孔的孔径一般在50~300Å之间。键合相键合在微球内外表面上,由于微孔如此之多,以至于微孔内表面的键合相占绝大多数。普通分析柱的微孔孔径在50~150Å之间,实践证明,只有尺寸小于孔径1/5的化合物才能自由出入微孔进而与键合相充分接触(充分接触是保留的必要条件而非充分条件),所以大分子化合物进入普通分析柱后,通常没机会进入微孔,而表面的键合相又太少,只能随流动快速地从微球的间隙中穿过。假设微球以最密堆积方式排列,间隙空隙率占柱床体积的25.94%,这是以微球等径、填充最紧密为前提的。对于一根4.6* 150 mm,100Å的色谱柱,流速为1 ml/min,忽略柱外死体积,大分子的出峰可能会在0.65 min附近,而其死时间一般在1.35 min附近。分子量的临界点并无统一说法,保守一些,可以2000 Da为界限。分子量超过这一数值的蛋白质、聚合物等在普通分析柱上很可能就会在死时间以前出峰。当需要穷尽每一个色谱峰归属的时候,对于出在死时间前的峰,可以按照上面的思路去排查。
既然有化合物可能会在死时间前面出峰,那么把第一个可辨认的色谱峰作为死时间的想法是不是很危险?那么死时间该怎么确定呢?应使用不保留化合物测出死时间!
在反相色谱柱(C18、C8、PH等)上,尿嘧啶凭借强极性和显著的吸收常常被选作不保留化合物。在实验室中,如果找不到尿嘧啶,也可以使用硝酸盐水溶液。更简单的是使用甲醇或水,比如低波长下,甲醇作流动相时就以水为样品,最明显的倒峰就是水的色谱峰。需要注意的一点是,进样体积应较小,比如1-2μl。下图是一根色谱柱的出厂测试报告,分析条件:流速0.8ml/min;柱规格,3*100mm, 2.7 μm。
 
 
图5.某色谱柱的出厂测试报告
图5中第一个色谱峰为尿嘧啶,因此死体积为0.473min * 0.8 ml/min=0.3784 ml。虽然此死体积包含了系统的死体积,假如不更换系统直接做其他样品,系统死体积不需扣除。后续如果用其他方法测试其他样品,那么死时间就等于0.3784 ml除以方法中的体积流速F。
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